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抗體的選擇和保存指南

更新時間:2014-07-01      點擊次數(shù):2699

 

                       抗體的選擇和保存指南         
  當我們要檢測目的蛋白在組織中表達情況的時候,如何選擇適合我們實驗需要的

抗體,并恰當保存使用,是每個科研人員需要細心考慮的??贵w種類繁多,品牌眾

多,技術(shù)參數(shù)不一,價格和質(zhì)量更是相差甚大,如何購買到高質(zhì)量價格合適的抗體

,并準確地做出我們想要的結(jié)果,其中有很多細節(jié)需要注意。 
一、怎樣選擇適合你實驗需要的抗體 

1、一抗選擇要點 
(1)確定抗體的名字,注意中英文名字、它名、亞型等信息。 
(2)確定你的實驗類型,Elisa,WB,IHC,ICC,還是FACS。一般抗體的說明書都

會列出該抗體經(jīng)驗證過適用于何種實驗的類型,如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類

型,并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型,而僅是說明尚未經(jīng)過此種實驗

驗證,請根據(jù)說明書列出的已驗證的類型來選擇適合你實驗的抗體。 
(3)確定實驗樣本的種屬,Human,Mouse,還是Rat。一般抗體說明書都列出該抗

體經(jīng)試驗驗證過適用于何種物種實驗,請根據(jù)說明書列出已驗證的種屬來選擇適合

你實驗的抗體。 
(4)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇zui合適的抗體,

待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域和樣本在提取和處理過程中是否會變性,蛋白空間構(gòu)象的改

變,會影響抗體的免疫親和反應(yīng)。
(5)單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主,一般單克隆抗

體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對就低;而多克隆抗體特異性稍

弱,但抗體的親和力強,靈敏度高,但易出現(xiàn)非特異性染色(可以通過封閉等避免

)。
2、二抗選擇要點 :
(1)種屬來源。主要根據(jù)一抗種屬來源來決定購買二抗來源,如一抗是小鼠來源

,那二抗就買抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。 
(2)標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇

Biotin標記的二抗,以與后面的SP結(jié)合反應(yīng),而免疫熒光染色就需要購買不同熒光

素標記的二抗,如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。
 二、抗體的穩(wěn)定性 
1. 抗體的穩(wěn)定性是自然界長期進化的結(jié)果??贵w是免疫系統(tǒng)中zui重要的分子之一

,其穩(wěn)定性是自然進化篩選的結(jié)果。在眾多物種中,抗體分子形成了保守而穩(wěn)定的

結(jié)構(gòu)。
 2. 抗體分子的高Tm值。在室溫下,甚至短時間溫度達到50-60℃,抗體分子都能

維持正確折疊,保持應(yīng)有的活性。 
3. 抗體的純度。采用先進的抗體純化技術(shù),確??贵w產(chǎn)品的高純度,保障其抗體

產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
 4. 抗體的濃度。高濃度的抗體產(chǎn)品可減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失,高濃度

的抗體穩(wěn)定性更好,抗體產(chǎn)品中93%的濃度大于0.5mg/ml。
 三、怎樣確定抗體購買渠道和品牌 
    國外抗體品牌的質(zhì)量一般沒問題,但價格較貴,而且很多抗體品牌本身不

生產(chǎn)抗體,隨著網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的越來越普及,我們自己就可以通過國內(nèi)外的相關(guān)來

檢索,國外zui大的生物試劑查詢:biocompare,大的生物試劑查詢

:丁香通,來查找我們所需要的產(chǎn)品資料。
 四、怎樣保存已獲得的抗體 
    抗體無論是保存還是運輸都應(yīng)盡可能地避免反復(fù)凍融,收到抗體后請根據(jù)實驗

的需要,對抗體進行分裝,避免同一管抗體反復(fù)凍融(反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體空間結(jié)

構(gòu)變性,導(dǎo)致多聚體形成,從而降低抗體的結(jié)合能力)??贵w保存得當與否,直接

決定了抗體的活性和使用效果,如果抗體保存得當,抗體活性大部分都可以維持數(shù)

年。請謹記,無論何時請按照說明書推薦的保存條件正確處理和保存抗體。
 1. 收到抗體后,請務(wù)必在4℃,12000rpm,離心3分鐘,(無論是液體還是凍干粉

狀態(tài)),再打開管蓋進行分裝和保存(如果抗體體積小于50ul,請延長離心時間至

5分鐘,以保證全部抗體均離心下來)??贵w一般使用特制的儲存管,只有在

12000rpm離心3分鐘,才能將附著在管壁或蓋內(nèi)的抗體全部離心下來(即使是在

10000rpm離心也會離心不*,導(dǎo)致出現(xiàn)抗體的量不足的現(xiàn)象)。
 2.(1)對絕大多數(shù)抗體來說,保存在-20℃就*足夠了,沒有任何證據(jù)顯示保

存在-80℃會更好。 
(2)分裝可以zui大程度的降低反復(fù)凍融對抗體活性的損害,同時也降低了由于多

次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。 
(3)分裝的量以一次實驗用完為好,zui少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小

,抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。 
(4)復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來。 

(5)抗體工作液應(yīng)該當天配制當天用完,4℃保存盡量不要超過1天。 
(6)避免將抗體保存在自動除霜冰箱中,將抗體保存在冰箱里層,避免溫度

變化造成反復(fù)凍融。 
 3.大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒有影響。
 4. 大部分抗體的運輸條件:一般的運輸過程需要1~2周的時間,所以是在低溫4℃

的條件下來完成的。 4℃運輸zui主要的目的是為了避免反復(fù)凍融對抗體活性的損害

(如果使用干冰運輸,那么收到時抗體是凍起來的,為了分裝就需要解凍,這就多

了一次凍融的過程),所以運輸過程中避免干冰運輸。 關(guān)于*

(sodium azide)的使用: 為了防止微生物污染,*經(jīng)常被加入到抗體中

(終濃度0.02% (w/v))。 
   注:*的去除方式 可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除,IgG的分子量

是150kDa(IgM約600kDa);*的分子量只有65Da,使用截留分子量為14kDa

的濾膜即可將*從抗體中去除。v                     抗體的選擇和保存指南
  當我們要檢測目的蛋白在組織中表達情況的時候,如何選擇適合我們實驗需要的

抗體,并恰當保存使用,是每個科研人員需要細心考慮的??贵w種類繁多,品牌眾

多,技術(shù)參數(shù)不一,價格和質(zhì)量更是相差甚大,如何購買到高質(zhì)量價格合適的抗體

,并準確地做出我們想要的結(jié)果,其中有很多細節(jié)需要注意。 
一、怎樣選擇適合你實驗需要的抗體 

1、一抗選擇要點 
(1)確定抗體的名字,注意中英文名字、它名、亞型等信息。 
(2)確定你的實驗類型,Elisa,WB,IHC,ICC,還是FACS。一般抗體的說明書都

會列出該抗體經(jīng)驗證過適用于何種實驗的類型,如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類

型,并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型,而僅是說明尚未經(jīng)過此種實驗

驗證,請根據(jù)說明書列出的已驗證的類型來選擇適合你實驗的抗體。 
(3)確定實驗樣本的種屬,Human,Mouse,還是Rat。一般抗體說明書都列出該抗

體經(jīng)試驗驗證過適用于何種物種實驗,請根據(jù)說明書列出已驗證的種屬來選擇適合

你實驗的抗體。 
(4)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇zui合適的抗體,

待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域和樣本在提取和處理過程中是否會變性,蛋白空間構(gòu)象的改

變,會影響抗體的免疫親和反應(yīng)。
(5)單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主,一般單克隆抗

體特異性強,但親和力相對小,檢測抗原靈敏度相對就低;而多克隆抗體特異性稍

弱,但抗體的親和力強,靈敏度高,但易出現(xiàn)非特異性染色(可以通過封閉等避免

)。
2、二抗選擇要點 :
(1)種屬來源。主要根據(jù)一抗種屬來源來決定購買二抗來源,如一抗是小鼠來源

,那二抗就買抗小鼠的即可(羊、兔等均可)。 
(2)標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇

Biotin標記的二抗,以與后面的SP結(jié)合反應(yīng),而免疫熒光染色就需要購買不同熒光

素標記的二抗,如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。
 二、抗體的穩(wěn)定性 
1. 抗體的穩(wěn)定性是自然界長期進化的結(jié)果。抗體是免疫系統(tǒng)中zui重要的分子之一

,其穩(wěn)定性是自然進化篩選的結(jié)果。在眾多物種中,抗體分子形成了保守而穩(wěn)定的

結(jié)構(gòu)。
 2. 抗體分子的高Tm值。在室溫下,甚至短時間溫度達到50-60℃,抗體分子都能

維持正確折疊,保持應(yīng)有的活性。 
3. 抗體的純度。采用先進的抗體純化技術(shù),確??贵w產(chǎn)品的高純度,保障其抗體

產(chǎn)品的穩(wěn)定性。
 4. 抗體的濃度。高濃度的抗體產(chǎn)品可減少容器表面吸附造成的物質(zhì)損失,高濃度

的抗體穩(wěn)定性更好,抗體產(chǎn)品中93%的濃度大于0.5mg/ml。
 三、怎樣確定抗體購買渠道和品牌 
    國外抗體品牌的質(zhì)量一般沒問題,但價格較貴,而且很多抗體品牌本身不

生產(chǎn)抗體,隨著網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的越來越普及,我們自己就可以通過國內(nèi)外的相關(guān)來

檢索,國外zui大的生物試劑查詢:biocompare,大的生物試劑查詢

:丁香通,來查找我們所需要的產(chǎn)品資料。
 四、怎樣保存已獲得的抗體 
    抗體無論是保存還是運輸都應(yīng)盡可能地避免反復(fù)凍融,收到抗體后請根據(jù)實驗

的需要,對抗體進行分裝,避免同一管抗體反復(fù)凍融(反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體空間結(jié)

構(gòu)變性,導(dǎo)致多聚體形成,從而降低抗體的結(jié)合能力)。抗體保存得當與否,直接

決定了抗體的活性和使用效果,如果抗體保存得當,抗體活性大部分都可以維持數(shù)

年。請謹記,無論何時請按照說明書推薦的保存條件正確處理和保存抗體。
 1. 收到抗體后,請務(wù)必在4℃,12000rpm,離心3分鐘,(無論是液體還是凍干粉

狀態(tài)),再打開管蓋進行分裝和保存(如果抗體體積小于50ul,請延長離心時間至

5分鐘,以保證全部抗體均離心下來)??贵w一般使用特制的儲存管,只有在

12000rpm離心3分鐘,才能將附著在管壁或蓋內(nèi)的抗體全部離心下來(即使是在

10000rpm離心也會離心不*,導(dǎo)致出現(xiàn)抗體的量不足的現(xiàn)象)。
 2.(1)對絕大多數(shù)抗體來說,保存在-20℃就*足夠了,沒有任何證據(jù)顯示保

存在-80℃會更好。 
(2)分裝可以zui大程度的降低反復(fù)凍融對抗體活性的損害,同時也降低了由于多

次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。 
(3)分裝的量以一次實驗用完為好,zui少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小

,抗體的濃度越可能會受到蒸發(fā)以及管壁吸附的影響。 
(4)復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來。 

(5)抗體工作液應(yīng)該當天配制當天用完,4℃保存盡量不要超過1天。 
(6)避免將抗體保存在自動除霜冰箱中,將抗體保存在冰箱里層,避免溫度

變化造成反復(fù)凍融。 
 3.大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒有影響。
 4. 大部分抗體的運輸條件:一般的運輸過程需要1~2周的時間,所以是在低溫4℃

的條件下來完成的。 4℃運輸zui主要的目的是為了避免反復(fù)凍融對抗體活性的損害

(如果使用干冰運輸,那么收到時抗體是凍起來的,為了分裝就需要解凍,這就多

了一次凍融的過程),所以運輸過程中避免干冰運輸。 關(guān)于*

(sodium azide)的使用: 為了防止微生物污染,*經(jīng)常被加入到抗體中

(終濃度0.02% (w/v))。 
   注:*的去除方式 可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除,IgG的分子量

是150kDa(IgM約600kDa);*的分子量只有65Da,使用截留分子量為14kDa

的濾膜即可將*從抗體中去除。   

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